Lactobacillus plantarum p5에서 정제된 정제된 Arginine Deiminase가 뮤린 유선선암 및 Vero cell line에 미치는 치명적 영향에 관한 연구

Arch Razi Inst. 2022 Feb; 77(1): 241–247.

 

초록

암은 인류가 직면한 가장 심각한 질병 중 하나로, 따라서 가능한 한 환자에게 해가 되는 일이 거의 없는 치료법을 찾는 것이 시급하다. 아르기닌 데이미나아제(ADI)는 혈장 아르기닌을 시트룰린으로 가수분해할 수 있다는 것이 승인되었다. 이러한 가수분해 활성 및 세포간 아르기닌 양의 감소는 리포다당류 유도 일산화질소 합성을 억제한다. 한편, 아르기닌의 고갈은 G1 단계에서 세포 주기를 억제하므로 ADI는 강력한 항암제로 간주되어 왔다. 본 연구는 Lactobacillus plantarum p5 균주에서 정제된 ADI가 쥐의 유선선암과 Vero 세포주에 미치는 치명적인 영향을 조사하는 것을 목표로 하였다. ADI를 1µg/mL에 노출시킨 후(3, 6, 24, 48, 72h) 배양 시간을 다르게 한 후, 뮤린 유선 선암에 대한 ADI의 항증식 활성을 동일한 조건의 Vero(비암세포주) 변형 세포주와 비교하여 평가하였다. 암세포에서의 오토파지 과정은 ADI로 3시간 배양한 후에 인식되었으며, 이는 역현미경으로 AMD3 세포주에서 명확하게 관찰되었다. 프로그래밍된 세포사(apoptosis) 경로의 첫 번째 단계는 ADI로 24시간 배양한 후에야 AMB3 세포에서 관찰되었으며, 이 과정은 72시간 배양 후 마지막 단계에 도달할 때까지 시간과 함께 계속되었다. 현재 연구의 결과는 암세포를 죽이는 강력한 활성을 가진 효소가 존재하는 상태에서 AMD3 세포주를 생성할 수 없기 때문에 AMD3 세포주가 아르기닌에 대한 보조영양학적이라는 것을 보여주었다.

 

1. 도입

뮤린 유선암은 선과 같은 패턴을 가진 상피세포의 악성 신생물을 나타내는 선암이다. 오토파지는 일부 영양소의 기아에 대한 세포 반응으로 발생하며, 특히 아미노산의 손실의 결과로 나타난다. 기아기에 오토파지 과정의 유도는 진핵생물에서 진화적으로 보호되는 스트레스 반응이다. 이 현상은 이중막 형태를 가진 오토파고솜의 구성으로 설명할 수 있다. 기아 기간 동안 오토파지의 자극은 진핵생물에서 진화적으로 보존된 스트레스 반응이다. 역현미경의 사용은 오토파지를 연구하는 데 더 인기 있는 기술로 여겨진다. Lactobacillus plantarum은 그람 양성의 광범위한 생균 유익균이며, Arginine(4)의 존재 하에서 Arginine deiminase(ADI) 효소를 생성할 수 있다. 정상 조직과 대조적으로, 일부 종양은 시트룰린(5)으로부터 아르기닌을 생성할 수 없다. 실제로 종양세포는 세포 내 아르기닌신생합성에 필수적인 아르기니노숙신생합성효소(ASS), 아르기니노숙신생합성효소(ASL) 등 필요한 효소를 갖고 있지 않다. 따라서 외인성 아르기닌은 이러한 세포의 성장과 증식에 필수적이다. ADI는 특히 매우 낮은 농도의 ADI에 의해 억제된 횡문근육종 및 교모세포종 세포주에서 아르기닌(6)을 소진함으로써 이러한 유형의 암에서 세포의 성장을 억제한다. 반대로, 과도 랫드 배아 섬유아세포 비암 세포주는 아르기닌(7, 8)을 생성할 수 있기 때문에 동일한 농도의 이 효소의 존재 하에서 증식한다. 암에 사용되는 가장 중요한 치료법 중 하나는 기존의 많은 약물에 의한 오토파지 과정의 유도이다. 여러 연구팀이 암세포에서 세포사멸과 자가포식 활성화에 대한 협력을 발견했다(9, 10). Globocan 데이터베이스는 2018년에 암 질환으로 인해 전 세계에서 1,800만 명의 치료를 받은 사람 중 9명 이상이 사망했으며, 이 숫자는 2030년까지 70%로 증가할 수 있다고 보고했다. 대부분의 치료법은 건강한 조직에도 해를 끼치기 때문에 암 질환에 대한 치료법을 찾는 것은 매우 복잡합니다. 따라서 환자의 몸을 위해 장기적으로 안전하고 위험하지 않은 치료법을 찾는 것이 매우 중요합니다.

ADI는 아르기닌을 생성하는 건강한 세포를 손상시키지는 않지만 아르기닌을 생성하는 건강한 세포를 손상시키지는 않는다. 따라서 본 연구에서는 프로바이오틱스 유익균에서 정제된 ADI가 암세포의 증식을 억제한 후 죽이는 작용을 하는 메커니즘을 Vero 형질전환(비암) 세포주와 비교하여 뮤린 유선암세포주를 조사하였다.

 

2. 세포주에서 ADI의 확산방지 활동
정제된 ADI의 AMB3 세포주와 Vero 세포주 모두에 대한 항증식 활성은 그림 1에서 설명된 바와 같이 측정되었으며, 이는 AMB3 세포가 3의 실험 기간 동안 100%에서 86%, 82%, 38%, 22%, 3%로 생존 능력을 감소시킴으로써 영향을 받은 두 세포주의 생존 능력에 대한 이 효소의 선택적 효과를 보여주었다, 각각 6, 24, 48, 72시간. 통계적 분석은 대조군 결과(Vero cell line)를 시간과 효소 농도 사이의 LSD 값을 갖는 P≤0.05에서 AMB3 결과와 비교하였을 때 유의한 차이를 보였다. 세포독성은 24시간 이후 뚜렷하게 나타났으며, 72시간 배양 후 억제율 97%로 점차 향상되었다. 결과는 AMD3 세포주의 증식을 위한 아르기닌의 중요성을 보여주었고, 따라서 ADI가 존재하는 상태에서 세포가 이 아미노산에 굶주렸을 때, 그들은 ASS와 ASL 생산 효소가 부족했기 때문에 다시 아르기닌을 생산할 수 없었다.

 

세포주의 식세포화 과정에 관한 연구
배양 후 3시간 후 암 AMN3 세포주를 역현미경으로 스캔했을 때 암세포 내부에 작은 원형 소포(autophagosome)가 생성되면서 식세포증 현상의 시작을 관찰했고, 6시간 후 세포를 검사했을 때 이들 소포의 수와 부피가 증가했다 ADI로 24시간 배양 후 세포를 검사했을 때 일부 조직세포는 서로 단절되고 분리되기 시작해 분해된 세포의 존재 외에도 일부 조직세포의 형태적 변화와 농축핵을 가진 세포군이 됐다.

이러한 현상은 시간이 지남에 따라 분해되지 않은 세포의 수가 감소한 48시간과 72시간 이후에 증가했다. 이러한 결과로부터, 아르기닌을 시트룰린(배양 매체에서)으로 전환할 때 효소는 암세포의 성장을 촉진함으로써 단백질 합성을 위한 아르기닌에 대한 필요성이 크기 때문에 암세포의 증식을 위해 이 중요한 아미노산을 소비했다고 결론지을 수 있다. 따라서, 그들은 아르기닌에 굶주렸고, 노출된 초기 시간에 오토파지의 과정이 자극되었다. 대부분의 암의 경우 오토파지 과정은 스트레스 반응(14)에서 비롯된다. 지속적인 기아 과정의 결과로, 세포는 그 기간 동안 ADI 생성물로서 NH3의 축적 외에도 아르기닌을 생성할 수 없다. 이러한 현상은 세포 단백질 및 효소 활성에 스트레스 효과가 있는 pH 지표 및 페놀레드가 존재하는 배양 배지 조건에서 pH가 향상됨으로써 조사되었다. 따라서 프로그램된 세포사의 경로에 대한 책임 유전자는 시간이 지남에 따라 점진적으로 유도되었고, 결과적으로 세포들은 서로 분리되었다. 그들의 형태를 바꾸고 그것들을 부서진 세포들로 분해함으로써, 많은 막 통과 단백질들이 세포들 사이의 접착 과정에 연루되었다고 설명될 수 있다. 따라서, ADI는 이러한 단백질들의 다수를 방해할 수 있다.

ADI로 3, 6, 24, 48, 72시간 배양 후 Vero 변형 세포주를 역현미경으로 검사한 결과 오토파고솜이 관찰되지 않았으며, 배양 기간 동안 세포는 건강했다. 즉, Vero 세포는 이러한 유형의 세포주에서 효소에 노출된 직후에 스스로 발현하는 ASS 및 ASL 유전자의 존재 및 유도에 의해 아르기닌을 생성할 수 있다. 이러한 발견을 확인하기 위해 본 연구에서는 세포 아포토시스 경로를 조사하였다.

 

본 연구의 결과로부터, Lactobacillus plantarum p5 균주로부터 정제된 ADI 효소는 배양 배지에서 아르기닌을 소진시키는 강력한 활성을 가지며, ANM3 세포주에 대한 시험관내 기아를 유발하므로, 세포 생존을 위해 배양 첫 시간 동안 오토파지 경로가 유도되었음을 알 수 있다. 그러나 이 세포들은 아르기닌의 신합성을 위한 효소를 필요로 하지 않았기 때문에 아르기닌을 생성할 수 없었다. 위에서 언급한 모든 점들은 ADI 부산물로서 NH3의 축적으로 이어지고, 결과적으로 배양 배지의 pH가 크게 증가하게 된다. 또한, 이러한 모든 현상들은 빠른 악성 진화를 위해 충분한 양의 아르기닌을 필요로 하기 때문에 세포의 성장과 증식에 부적절한 조건을 초래한다. 이러한 이유로 일부 세포에서 24시간 배양 후에 세포사멸이 관찰되었고 72시간 이내에 대부분의 세포가 파괴될 때까지 시간이 지남에 따라 점진적으로 증가했다.

일부 연구자들은 일부 암 조직(전립선, 소세포 폐, 췌장, 망막아세포종, 백혈병 암세포)에서 ADI의 존재가 미토콘드리아 기능 장애에 의해 자동식단 경로를 유도한다는 것을 보여주었다. 그 후, 이 과정은 아포토시스 경로(16, 17)를 유도함으로써 감소하였다.

변형된 Vero 세포주에서, 결과는 이러한 세포들이 모든 배양 시간 동안 ADI의 존재에 영향을 받지 않는다는 것을 보여주었다. 그림 5는 ADI를 가진 Vero 세포를 72시간 배양한 후 대부분의 처리된 세포가 적혈구질 영역으로 건강하게 유지되었으며, 대조군(그림 6) 비처리된 세포와 비교하여 변화가 없음을 보여주었다. 결과에 따르면, Vero 변형 세포주는 ASS 및 ASL 효소의 존재에 의해 아르기닌을 생성하는 능력을 가지고 있었고, 따라서 세포는 여전히 건강하고 굶주리지 않았다. 대부분의 연구진은 ADI가 정상 세포(12)를 해치지 않고 암 세포(18)만 손상시킨다는 사실을 확인했다. 암세포는 ADI의 존재에 의해서만 영향을 받았기 때문에, 이 효소는 암세포에만 독성 효과가 있으며, 변형된 세포는 ADI의 존재에서 안전하다는 결론을 내릴 수 있다. 이에 따라 향후 이 제품의 개발은 자연세포에 손상을 주는 치료제 대신 대체의약품으로 활용하는 것이 좋다.

 

3. 결론
결과에 따르면, 뮤린 유선암세포주는 이러한 암세포를 죽이는 강력한 활성을 가진 ADI 효소가 존재하는 상태에서는 생산할 수 없기 때문에 아르기닌에 대한 보조영양학적이라는 결론을 내릴 수 있다. 게다가, Vero 비암 세포주는 ADI의 존재 하에서 생성될 수 있기 때문에 아르기닌에 대한 보조영양학적이지 않았다. 따라서, 이 효소는 암세포주에 세포독성이 있기 때문에 향후 암 치료제로 사용되기를 희망하지만, 안전하고 정상적인 세포주를 해치지 않는다.