프로바이오틱스가 함유된 요구르트가 호흡기 바이러스 감염에 미치는 영향: 인플루엔자 H1N1 및 SARS-CoV-2

J Dairy Sci. 2023 Jan 9

 

초록

호흡기 바이러스 감염은 증가하는 문제이며 전 세계적으로 흔해졌다. 인플루엔자와 COVID-19는 대표적인 감염성 호흡기 질환으로, 다양한 합병증으로 이어지는 경우가 있다. 확립된 약물이나 치료법이 존재하지 않는 상황에서 적절한 음식을 섭취하는 것이 외부 감염에 대한 건강을 유지하는 데 도움이 될 수 있다. 우리는 프로바이오틱스 균주의 혼합물이 다양한 바이러스 감염에 미치는 잠재적 영향을 연구했다. 본 연구의 목적은 프로바이오틱스가 함유된 요구르트가 인플루엔자 H1N1, SARS-CoV-2 감염과 같은 호흡기 바이러스의 위험을 감소시키는 능력을 평가하는 것이었다. 먼저, 인플루엔자 H1N1 및 SARS-CoV-2 감염에 대한 고용량 프로바이오틱스가 포함된 요구르트의 잠재적 영향을 평가하기 위해 감염된 MDCK(Madin-Darby 개 콩팥) 및 Vero E6 세포를 사용하여 체외 테스트를 수행했습니다. 요구르트는 바이러스에 감염된 세포에서 플라크 형성을 현저하게 감소시켰다. 또한 요구르트의 잠재적 효과를 평가하기 위해 인플루엔자 H1N1 감염 C57BL/6 마우스와 SARS-CoV-2 감염 시리아 골든 햄스터를 사용하여 생체 내 테스트를 수행했다. 요구르트는 실험 기간 동안 하루에 한 번 경구 투여되었다. 요구르트도 바이러스 감염 전 3주간 매일 1회씩 경구 투여했다. 인플루엔자 H1N1과 관련하여 요구르트는 바이러스 감염에 대한 생존율, 체중, IFN-항체, IgG1, IL-10 수치의 증가와 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 감소를 유발하는 것으로 나타났다. 요구르트 처리된 SARS-CoV-2 감염 햄스터의 폐에서는 SARS-CoV-2 복사수가 유의하게 감소하지 않았지만, 요구르트 처리된 그룹에서는 폐의 체중과 조직병리학적 소견이 개선되었다. 결론적으로, 우리는 프로바이오틱스가 함유된 요구르트의 섭취가 호흡기 바이러스 감염을 예방하는 유익한 효과로 이어질 수 있음을 제안한다.

 

1. 도입

최근 세계적으로 코로나바이러스 감염증(CoV)이 큰 문제이자 인간 건강에 대한 위험으로 지목되면서 대표적인 호흡기 바이러스 감염증인 인플루엔자의 대체재로 부상하고 있다(Avolio et al., 2022). 호흡기 바이러스 감염의 위험은 폐쇄된 환경에서 물방울과 공기를 통한 감염 경로와 같이 빠르고 다양하기 때문이다(von Linstow et al., 2008; Tagliamonte et al., 2021).

사람과 다른 종을 포함한 포유류의 유행성 호흡기 질환의 주요 원인은 인플루엔자 바이러스인 것으로 알려져 있다(Maragkoudakis et al., 2010; DeGrandi-Hoffman and Chen, 2015). 인플루엔자 바이러스는 거의 매년 겨울에 전염되며, 인플루엔자 바이러스 감염은 많은 나라에서 사회적, 경제적 위험을 초래한다. 심각한 인플루엔자 감염은 염증성 사이토카인인 종양괴사인자-α(TNF-α)와 인터류킨-6(IL-6)의 수치를 증가시킨다. 이러한 사이토카인의 수치 증가는 치명적인 감염 과정에서 종종 관찰되었다(Van Reeth et al., 1998; Julkunen et al., 2001; Kaiser et al., 2001),

또한, 인플루엔자 바이러스 감염은 임산부, 당뇨병 환자, 유아 및 노인을 포함한 고위험군에게 위험하다(Boyd et al., 2006; Lynch and Walsh, 2007). 이러한 고위험군은 바이러스 감염에 대한 면역 반응이 충분하지 않으며 종종 심각하고 치명적인 상태를 보인다. 따라서 인플루엔자의 심각하고 치명적인 상태를 예방하기 위해서는 외래 항원에 대한 장벽을 형성하는 면역체계의 적절한 유지가 필수적이다(Nakayama et al., 2014).

Orthocoronavirinae에 속하는 코로나바이러스는 사람과 다른 종을 포함한 포유류 종을 감염시킨다(Islam et al., 2021). 다양한 CoV가 지난 20년 동안 인간 사회를 위협해 왔다. 특히 코로나바이러스병 2019(코로나19)를 유발하는 중증급성호흡기증후군 CoV(SARS-CoV), 중동호흡기증후군 CoV(MERS-CoV), 사스-CoV-2는 2002년, 2012년, 2019년에 전 세계 건강에 악영향을 미쳤다(Ning et al., 2021). SARS-CoV-2 감염의 경미한 증상은 인플루엔자 및 기침, 발열, 피로와 같은 일반적인 감기 유사 질환과 유사한 반면, SARS-CoV-2의 중증 증상은 심한 호흡곤란, 다초점 폐렴, 급성 호흡곤란 증후군 및 다장기 기능 장애 증후군을 포함한다(Elhamzaui et al., 2021). 전 세계 면역-순수 인구가 효율적인 SARS-CoV-2 전염의 원인이며, 이 바이러스는 2022년 6월까지 5억 3600만 명 이상을 감염시키고 630만 명 가까이 사망했다(WHO, 2022).

 

인플루엔자와 CoV 감염의 경우 백신 접종을 통한 예방이 매우 중요하지만, 접종한 바이러스 백신이 백신 생산 항체와 현재의 유행성 바이러스 균주와 일치하지 않으면 바이러스 확산을 막을 수 없다. 따라서 일상생활에서 면역력을 높이고 개인위생을 유지하며 영양가 있는 음식을 섭취하는 것이 중요하다.

유제품에서 나오는 프로바이오틱스는 전세계적으로 매일 소비된다. 프로바이오틱스는 유산균과 비피도박테리움을 포함한 많은 속에 속하는 박테리아 그룹인 많은 유산균을 포함한다. 이들은 또한 장 질환, 당뇨병 및 암에 유익한 효과가 있으며, 면역 조절을 통해 감염성 질환에 대한 방어력을 향상시키는 것으로 보고되었다(MacDonald and Bell, 2010; Hill et al., 2017). 우리의 테스트 제품은 남양유업에서 제공하는 요거트(불가리스)이다. Streptococcus termophilus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium animalis ssp 등의 고선량 프로바이오틱스 함유. 락티스 Bb-12, Limosilactobacillus fermentum PL9988(bulgaris Kor91), 락티플랜티바실러스 plantarum SN35N, L. acidophilus NCFM, B. lactis Bi-07 등은 사람에게 유익한 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

본 연구의 목적은 고용량 프로바이오틱스 요구르트(Bulgaris) 치료가 인플루엔자, 사스-CoV-2 등 바이러스성 호흡기 감염에 미치는 전반적인 영향을 규명하고자 하였다. 이 목적을 달성하기 위해, 우리는 시험관 내에서 요구르트가 인플루엔자 H1N1과 SARS-CoV-2 감염에 미치는 잠재적인 영향을 평가했다. 우리는 인플루엔자 H1N1과 SARS-CoV-2에 대한 요구르트의 긍정적인 효과를 평가하기 위해 바이러스에 감염된 동물 모델을 사용하여 생체 내 실험을 수행했다.

 

2. 실험방법

테스트 제품
테스트 제품은 요구르트(불가리스, 남양유업)다. Ltd.)는 S. thermophilus, L. acidophilus, Bifidobacterium animalis ssp와 같은 고선량의 프로바이오틱스를 함유한다. Lactis Bb-12, Limosilactobacillus fermentum PL9988(불가리스 Kor91), Lactiplantibacillus plantarum SN35N, L. acidophilus NCFM 및 B. lactis Bi-07, 2.1 × 109 cfu/mL. 테스트 제품은 한국 익산의 한 유제품 소매점에서 구입하여 제조 후 1주일 이내에 사용하였다. 시험 제품은 실험 기간 동안 4°C에 저장되었다.

세포 배양 및 체외 실험
마딘-다비 개 신장(MDCK) 세포는 인플루엔자 체외 실험을 위해 한국 셀라인 은행으로부터 획득되었다. 세포는 태아 소 혈청 10%, 페니실린 100 U/mL, 스트렙토마이신 100 µg/mL로 보충된 최소한의 필수 배지로 유지되었다. 배양 조건은 5% CO2에서 37°C였다.

Vero E6 세포는 SARS-CoV-2 체외 실험을 위해 미국 유형 배양 컬렉션에서 획득되었습니다. 세포는 태아 소 혈청 10%, 페니실린 100 U/mL, 스트렙토마이신 100 µg/mL로 보충된 최소한의 필수 배지로 유지되었다. 배양 조건은 5% CO2에서 37°C였다.

인간 인플루엔자 바이러스 A/PR/8/1934형(H1N1)과 SARS-CoV-2형(Lclade)은 질병관리본부가 제공했다. 요구르트의 억제 효과를 평가하기 위해 플라크 분석을 수행하였다.

간단히, 요구르트를 각 바이러스주(4 × 106 pfu/mL)와 1:9(vol/vol)의 비율로 25 ± 1°C에서 2시간 동안 혼합하였다. 6-웰 플레이트 또는 12-웰 플레이트의 각 세포의 합류 단층을 37°C에서 5% CO2에서 2시간 동안 37-6까지 세포 배양 배지에 연속적으로 희석된 요구르트와 바이러스를 포함하는 혼합물(0.5 mL)로 처리하였다. 각 웰의 혼합물을 제거하고, 이어서 오버레이 매질(1 mL)을 각 웰에 추가하였다. 플레이트는 72시간 동안 반전된 위치에서 배양하여 플라크 형성 여부를 관찰하고, 감염된 세포를 고정시키기 위해 4% 중성 완충 포르말린(NBF) 1 mL를 넣고 최소 30분 이상 방치하였다. 오버레이 매질과 4% NBF를 제거하고, 0.05% 크리스탈 바이올렛 용액 500 μL를 첨가하여 활성 세포를 염색하였다. 과잉된 수정 바이올렛을 제거하고 형성된 플라크를 계수하여 밀리리터당 플라크 수를 계산하였다. 환원율은 다음 공식으로 계산되었다:

감소율(%) = (바이러스통제 역가 - 요구르트 역가)/바이러스통제 역가 × 100.
인플루엔자 생체내 실험
이 연구에는 총 75마리의 7wk-secific-pathogen-free 마우스(C57BL/6)가 사용되었다. 그 쥐들은 환경적으로 통제된 방에 수용되었다. 온도는 23 ± 3°C, 상대습도는 55 ± 15%, 환기빈도는 시간당 10~20회, 점등시간은 12h/d(0800~2000h), 조도는 150~300lx이었다. 음식과 물은 자유롭게 이용할 수 있었다. 이 동물 연구는 인증번호 IACUC 21-KE-380인 노투스(인천, 한국)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다.

 

 

 

우리의 테스트 제품은 S. 써모필루스, L. acidophilus, Bifidobacterium animalis ssp와 같은 고용량의 프로바이오틱스가 함유된 요구르트입니다. 사람에게 유익한 효과가 잘 알려진 락티스 Bb-12, 리모실락토바실러스 페멘툼 PL9988(불가리스 Kor91), 락티플랜티바실러스 plantarum SN35N, L. acidophilus NCFM, B. lactis Bi-07. 이 요구르트에 대한 선행 연구는 구강 세균의 감소 및 구강 세균에 의해 유도되는 바이오필름 형성 억제와 관련하여 치아 건강에 유익한 효과를 입증하였다(Sin et al., 2009). 생물학적, 병리학적 측면에서 바이러스와 박테리아의 차이는 있지만, 바이러스 감염과 관련된 프로바이오틱스에 대한 다른 연구를 바탕으로 이 요구르트의 섭취가 호흡기 바이러스 감염을 억제하는지 조사하였다.

요구르트가 인플루엔자 H1N1과 SARS-CoV-2에 모두 영향을 미치는지 조사하기 위해 먼저 인플루엔자 H1N1과 SARS-CoV-2에 대한 체외 연구 결과를 확인했다. 그림 1에서 보는 바와 같이, 요구르트 치료에 의해 인플루엔자 H1N1과 SARS-CoV-2의 플라크 형성이 억제되었다. 요구르트 처리된 그룹의 인플루엔자 H1N1은 처리되지 않은 인플루엔자 H1N1 그룹에 비해 플라크 형성이 나타나지 않았다. 이 결과는 인플루엔자 H1N1의 이전 연구에 의해 발견된 바이러스 배양 세포에서 프로바이오틱스가 포함된 바이러스 역가의 감소를 의미할 수 있다(Bae et al., 2018; Rather et al., 2022). 요구르트 처리된 그룹의 SARS-CoV-2는 10-3 희석에서 약간의 플라크 형성을 보였다. 바이러스 배양 세포에서 프로바이오틱스 치료를 사용한 SARS-CoV-2에 대한 이전 연구에서는 우리의 결과와 유사한 바이러스 역가 감소가 나타났다(Wang et al., 2020; Islam et al., 2021; Rather et al., 2021; Salaris et al., 2021).

이에 따라 인플루엔자 H1N1과 SARS-CoV-2로 생체 내 연구를 수행했다. 요구르트는 감염일 3주 전에 쥐에게 투여되었다. 생쥐는 인플루엔자 H1N1에 감염되었고, 요구르트 투여는 실험 기간이 끝날 때까지 유지되었다.

그림 2에서 보는 바와 같이, 요구르트 처리된 그룹은 바이러스 감염 그룹보다 더 나은 생존율을 보였으며, BW의 빠른 회복을 보였다. 임상 점수는 바이러스에 감염된 그룹보다 요구르트 처리된 그룹에서 낮았다. 면역반응이 요구르트에 의해 유도되는지 여부를 확인하기 위해 혈청분석을 실시하였다. 요구르트 투여 후 3주 후 IFN-항원과 IgG1 수치가 증가하였다. IFN-항체는 바이러스 감염 및 Th1 반응의 유도에 관여하는 사이토카인으로서 중요한 역할을 하며, 면역 반응 능력을 높여 바이러스 감염을 예방하는 역할을 할 수 있다(Julkunen et al., 2001; Mahooti et al., 2019). IgG1은 보체 활성화 및 NK세포 활성화를 지원하여 바이러스 감염에 대한 저항력을 높이는 데 도움이 될 것으로 기대된다(Mahooti et al., 2019). 따라서 인플루엔자 바이러스 감염의 영향을 확인하기 위해 BALF 내 호중구와 단구를 분석하였다(그림 3A 및 3B). 예상외로 호중구와 단핵구의 경향성은 바이러스 감염군과 요구르트 처리군 사이에 차이가 없는 반면, 요구르트 처리군에서는 바이러스 감염군에 비해 단핵구의 수가 약간 증가하였다. CD11b+Ly-6C+ 단구는 바이러스 감염에 대항하여 필수적인 세포로서, 바이러스를 제거하는 역할을 하는 염증성 대식세포로 분화되어 있으며, 감염의 중후기에는 손상된 조직의 회복에 관여하는 중요한 면역세포인 항염증성 대식세포로 분화되어 있다(Chen et al, 2017; Coates et al., 2018).

또한 혈청 및 BALF TNF-α, IL-6, IL-10 수준을 분석하기 위해 생체 내 연구를 수행했습니다. 5 DPI의 혈청에서, 바이러스 감염에 의해 유도된 전염증성 사이토카인 IL-6의 수치가 바이러스 감염 그룹에 비해 요구르트 처리 그룹에서 유의하게 감소하였다(Julkunen et al., 2001; Kaiser et al., 2001). 5 DPI의 BALF에서 항염증성 사이토카인인 IL-10의 수치(Kaiser et al., 2001)는 바이러스 감염 그룹에 비해 요구르트 처리 그룹에서 유의하게 증가하였다(그림 3C). 이러한 결과는 요구르트가 5DPI에서 생쥐의 인플루엔자 바이러스에 의해 유발된 염증을 개선시켰음을 나타낸다. 이전에 프로바이오틱스의 투여가 5 DPI에서 마우스의 인플루엔자 예방에 효과적이라는 보고가 있었다(Nakayama et al., 2014). 조직병리학적 결과는 폐 조직의 염증 세포 침투 감소를 통해 인플루엔자 H1N1 바이러스에 대한 요구르트의 유익한 효과를 뒷받침한다(그림 4). 이러한 결과는 요구르트의 섭취가 인플루엔자 H1N1에 감염된 C57BL/6 생쥐에게 항인플루엔자 효과가 있음을 시사한다.

이 연구에서는 SARS-CoV-2에 감염된 햄스터가 경구 투여된 요구르트를 조사했다. 예상한 바와 같이, SARS-CoV-2에 감염된 요구르트 처리 햄스터의 BW는 모든 시점에서 바이러스에 감염된 그룹에 비해 유의하게 증가하였다(그림 5A).